导语:摇瓶的使用对动物细胞的培养越来越重要。以下各摇瓶中培养CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的示例表明,Multitron细胞培养摇床(INFORS HT,CH Bottmingen)适合种子液的生产。
1. 简介
摇瓶的使用对动物细胞的培养越来越重要。以下各摇瓶中培养CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的示例表明,Multitron细胞培养摇床(INFORS HT,CH Bottmingen)适合种子液的生产。
CHO细胞系是生物技术中常用的细胞系。为了生产用于接种的种子培养液和生产SEAP蛋白,使用了CHO-XM-111细胞株。瑞士苏黎世联邦理工学院 M.Fussengerger 教授的团队用编码重组蛋白SEAP(分泌型碱性磷酸酶)基因的表达载体转染该细胞株,并使用由四环素控制的启动子PhCMV-1。表达载体的使用使得通过启动子可选择性表达两个基因成为可能。这样就可以生产SEAP蛋白,包括非生产性的生长阶段,和基于无四环素培养基交换的增殖抑.制生产阶段。
2. Multitron 技术参数
* 50 mm 振幅 (可选25mm)
* 通气 空气和 CO2 (0 – 20% asstandard)
* 蒸汽湿度套件(可选)
* 不同可选托盘 (一次培养袋托盘, 粘性托盘,通用托盘等)
* 其他选项 (制冷, 去污, ShakerBag等)
3. 实验条件
为了在生物反应器中生产种子培养液(作为后期培养的接种物)和SEAP,使用CHO-XM-111细胞系,无血清和无蛋白的HP-1培养基(Cell Culture Technologies GmbH)在250 mL、500 mL和1000mL摇瓶中进行培养。在培养基中添加2g/L Pluronic F-68(Sigma)和2.5 mg/L 四环素(Sigma)。设置温度37℃,湿度85% 和5%的CO2饱和度。摇瓶以恒定的122 rpm转速在Multitron(INFORS-HT, CH-Bottmingen)中培养。
4. 批次补料振荡培养
采用不同体积的摇瓶和相应的补料策略。
a) 在250ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行:
体积(mL) |
每毫升细胞浓度 |
存活百分比 |
|
0 d/0 h – 接种 |
50 |
3.0 x 105 |
86.9 |
1 d/21 h – 补料 |
50 (+ 30 mL) |
6.6 x 105 |
91 |
2 d/43 h |
80 (max. 32%) |
1.95 x 106 |
97.4 |
3 d/67 h |
80 |
2.25 x 106 |
98.3 |
4 d/91 h |
80 |
1.95 x 106 |
98.7 |
Z大比生长速率μmax为0.048 h-1,倍增时间td =14.4h。
图1: Multitron
b) 在500ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行:
天/小时 – 步骤 |
体积(mL) |
每毫升细胞浓度 |
存活百分比 |
0 d/0 h – 接种 |
100 |
7.8 x 105 |
95.5 |
1 d/24 h – 补料 |
100 (+ 50 mL) |
1.88 x 106 |
98.7 |
2 d/47 h – 补料 |
150 (+ 50 mL) |
2.18 x 106 |
99.1 |
3 d/67 h – 更换培养基 |
250 (+ 50 mL) |
2.33 x 106 |
99.3 |
4 d/91 h |
300 (max. 60%) |
2.63 x 106 |
99.7 |
5 d/115 h |
300 |
4.65 x 106 |
99.4 |
6 d/139 h |
300 |
3.90 x 106 |
98.1 |
7 d/163 h |
300 |
2.55 x 106 |
81.8 |
Z大比生长速率μmax为0.024 h-1,倍增时间td =28.9h。
c) 在1000ml摇瓶中的培养过程按照以下模式进行:
天/小时 – 步骤 |
体积(mL) |
每毫升细胞浓度 |
存活百分比 |
0 d/0 h – 接种 |
150 |
6.6 x 105 |
98.9 |
1 d/23 h – 补料 |
150 (+ 50 mL) |
9.6 x 105 |
98.9 |
2 d/45 h – 补料 |
200 (+ 50 mL) |
1.95 x 106 |
99 |
3 d/66 h – 补料 |
250 (+ 50 mL) |
1.10 x 106 |
99.3 |
4 d/93 h |
300 |
2.18 x 106 |
99.4 |
5 d/117 h – 15-fold dilution |
400 (max. 40%) |
2.25 x 106 |
98.5 |
8 d/189 h |
400 |
1.40 x 106 |
66.9 |
Z大比生长速率μmax为0.044 h-1,倍增时间td =15.65h。
d) 蒸汽加湿
为了检测每日液体损失,使用125 mL摇瓶,工作体积为15 mL、20 mL和25 mL,在温度为37°C,湿度为85% rH的培养前后测定总体积。
5. 分析
a) 参数分析
每天使用细胞计数器yc100(Chemotec)测定活细胞浓度。使用Bioprofile Analyzer 100 Plus(Nova Biomedical)完成生长和生产基质的分析
b)公式
对于Z大生长速率μmax和倍增时间td的计算,使用以下公式。
6. 结果分析
为了优化CHO种子液培养,在Multitron细胞培养摇床中设置了三个不同体积的摇瓶(250ml、500ml和1000ml)。在培养CHO-XM-111细胞的同时,每天取样检测,从而可以**地比较细胞浓度、底物消耗和缓冲液。
对比Z大细胞浓度表明,500ml 摇瓶中的培养物每毫升可产生4.65×106个细胞。在培养物中,6天内可达到98%以上的存活率。通过优化补料策略,种子培养可在2天后进行,Zui多5天(图2)。
图2:对比细胞浓度和活力
葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量,尤其在500mL摇瓶中,表明底物在第五天之前是足够的,因此补料可防止底物限制(图3).
图3:对比葡萄糖和谷氨酰胺
已知同时形成铵,乳酸和谷氨酸可降低细胞生长速率。在培养物中,在培养的第五天也观察到亚临界浓度的铵。此外,通气和连续供应5%的CO₂可以为培养系统提供**缓冲,因此也可以提供合适的pH条件(图4)。
图4:比较铵的含量,谷氨酸盐,乳酸和pH
直接蒸汽加湿对培养基损失有重要影响,同时也会改变渗透压。
特别是在小工作体积下,一天的Z大蒸发量小于0.4%。
图5:125mL挥发量
摇瓶的工作体积对氧交换有很大影响,不应超过摇瓶Zui适工作体积。
7. 总结
培养2-5天后,细胞总数达到1.8 x 10⁸和1.4 x 10⁹之间。它可用作2.5L生物反应器的接种物,活细胞浓度约为每毫升5×10⁵。
接种细胞密度和细胞活力越高,培养过程中细胞密度越高。
**尽早更换培养基
在较小接种量和**补料策略允许的情况下,可额外补充细胞培养营养物质。另一方面,培养液被稀释,因此有毒产物减少。
在85%相对湿度条件下,蒸发量小于0.5%,可实现稳定的渗透压和工艺再现性。
摇瓶培养可用于进一步的工艺步骤,例如接种生物反应器或一次性袋。
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