培养细胞中的线粒体提取

2018-01-18 20:06:00 infors8863 分享

导语：分离线粒体的原理：从组织或细胞中分离线粒体的关键步骤，大致相同

——使用杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer

本文仅用于研究用途

一、介绍

分离线粒体的原理：从组织或细胞中分离线粒体的关键步骤，大致相同：（1）通过机械和/或化学手段使细胞破裂，（2）低速离心以除去杂质和较大的细胞器，随后以较高的速度离心，以分离收集的线粒体。此种线粒体分离方法可以满足大多数应用。下述步骤详述提取步骤，旨在提供能够获得尽可能高产量和酶活性的线粒体。

二、实验方案（详见6操作步骤）

1、冻融法弱化细胞膜，以5.0mg / ml悬浮于试剂A中，置于冰上10分钟。

2、使用杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer 匀浆，损坏细胞膜

3、SPIN 1: 4°C温度下1000g离心力，离心10分钟，收集上清液#1. 重复收集上清液#2

4、SPIN 2: 4°C温度下12,000g离心力，离心15分钟，弃上清，保留沉淀。

5、加入C试剂，蛋白酶抑制剂，使用涡旋振荡器重悬沉淀，分装-80°C保存

6、线粒体测定：蛋白质浓度，OXPHOS活性，Western Blot

三、关键试剂和仪器

1、试剂A 50ml

2、试剂B 50ml

3、试剂C 10ml

4、杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)

5、涡旋混合器VORTEX3000

6、低温高速离心机BIOCEN 22R

四、存储条件

试剂A/B/C， 4°C存储

五、其他试剂和仪器

1、双蒸水

2、蛋白酶抑制剂（PI）

3、BCA蛋白质分析

4、2ml离心管

5、天平等实验室常规设备

六、操作步骤

线粒体制备遵循三个简单的步骤：细胞破裂，离心去除杂质和大的细胞器，离心分离线粒体。以下是从培养的人类细胞中制备线粒体的指导原则。试剂和样品应尽可能冷藏。建议使用4 x 150 mm的融合细胞平板（约4x107个细胞）。

1、收集细胞：在贴壁细胞的情况下，它们可以用细胞提取器收集，并通过在1000g离心沉淀。每个平板通常产生2mg全细胞蛋白质。这可通过蛋白质测定来检查。

2、使用冻融发弱化细胞膜

3、按照5mg蛋白加入1ml试剂A量进行计算，在2ml离心管中重悬细胞

4、冰上放置10min

损坏细胞膜：

5、将细胞转入预冷的杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)中。.

6、使用LOOSE杵，匀浆30次

7、转移匀浆液到2ml离心管中.

SPIN 1:

8、 4°C温度下1000g离心力，离心10分钟

9、收集上清液#1.

10、加入试剂 B 重悬沉淀，加入体积与第3步等同.

11、重复损坏细胞膜和 SPIN1中的第8步.

12、收集上清液，记作(SN) #2，丢弃沉淀

13、充分混合 #1 & #2, 加到2ml离心管中，如果超过2ml 请均分到两个离心管中

SPIN 2:

14、4°C温度下12,000g离心力，离心15分钟

15、弃上清，保留沉淀

16、使用500μl试剂C，重悬沉淀，同时加入蛋白酶抑制剂

17、分装-80°C保存备用.

七、常见问题分析

问题	可能引起原因	解决方法
线粒体离心沉淀很少	没有充分将细胞破碎	增加匀浆次数
大量的细胞色素C	细胞过度溶解/细胞不新鲜	减少匀浆次数/选取新鲜细胞
线粒体纯度低	存在污染	降低SPIN2离心力到6000g