导语:分离线粒体的原理:从组织或细胞中分离线粒体的关键步骤,大致相同
——使用杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer
本文仅用于研究用途
一、介绍
分离线粒体的原理:从组织或细胞中分离线粒体的关键步骤,大致相同:(1)通过机械和/或化学手段使细胞破裂,(2)低速离心以除去杂质和较大的细胞器,随后以较高的速度离心,以分离收集的线粒体。 此种线粒体分离方法可以满足大多数应用。 下述步骤详述提取步骤,旨在提供能够获得尽可能高产量和酶活性的线粒体。
二、实验方案(详见6操作步骤)
1、冻融法弱化细胞膜,以5.0mg / ml悬浮于试剂A中,置于冰上10分钟。
2、使用杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer 匀浆,损坏细胞膜
3、SPIN 1: 4°C温度下1000g离心力,离心10分钟,收集上清液#1. 重复收集上清液#2
4、SPIN 2: 4°C温度下12,000g离心力,离心15分钟,弃上清,保留沉淀。
5、加入C试剂,蛋白酶抑制剂,使用涡旋振荡器重悬沉淀,分装-80°C保存
6、线粒体测定:蛋白质浓度,OXPHOS活性,Western Blot
三、关键试剂和仪器
1、试剂A 50ml
2、试剂B 50ml
3、试剂C 10ml
4、杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)
5、涡旋混合器VORTEX3000
6、低温高速离心机BIOCEN 22R
四、存储条件
试剂A/B/C, 4°C存储
五、其他试剂和仪器
1、双蒸水
2、蛋白酶抑制剂(PI)
3、BCA蛋白质分析
4、2ml离心管
5、天平等实验室常规设备
六、操作步骤
线粒体制备遵循三个简单的步骤:细胞破裂,离心去除杂质和大的细胞器,离心分离线粒体。 以下是从培养的人类细胞中制备线粒体的指导原则。 试剂和样品应尽可能冷藏。 建议使用4 x 150 mm的融合细胞平板(约4x107个细胞)。
1、收集细胞:在贴壁细胞的情况下,它们可以用细胞提取器收集,并通过在1000g离心沉淀。 每个平板通常产生2mg全细胞蛋白质。 这可通过蛋白质测定来检查。
2、使用冻融发弱化细胞膜
3、按照5mg蛋白加入1ml试剂A量进行计算,在2ml离心管中重悬细胞
4、冰上放置10min
损坏细胞膜:
5、将细胞转入预冷的杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)中。.
6、使用LOOSE杵,匀浆30次
7、转移匀浆液到2ml离心管中.
SPIN 1:
8、 4°C温度下1000g离心力,离心10分钟
9、收集上清液#1.
10、加入试剂 B 重悬沉淀,加入体积与第3步等同.
11、重复损坏细胞膜和 SPIN1中的 第8步.
12、收集上清液,记作(SN) #2,丢弃沉淀
13、充分混合 #1 & #2, 加到2ml离心管中,如果超过2ml 请均分到两个离心管中
SPIN 2:
14、4°C温度下12,000g离心力,离心15分钟
15、弃上清,保留沉淀
16、使用500μl试剂C,重悬沉淀,同时加入蛋白酶抑制剂
17、分装-80°C保存备用.
七、常见问题分析
问题 |
可能引起原因 |
解决方法 |
线粒体离心沉淀很少 |
没有充分将细胞破碎 |
增加匀浆次数 |
大量的细胞色素C |
细胞过度溶解/细胞不新鲜 |
减少匀浆次数/选取新鲜细胞 |
线粒体纯度低 |
存在污染 |
降低SPIN2离心力到6000g |
杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer
VORTEX3000
低温高速离心机BIOCEN 22R
附录一(参考 ab110171 ):
Copyright © 22024 INFORS 京ICP备17022874号-3 京公网安备 11010502047771号